多種實驗室常用方法

2021-04-28 14:34:12  微生物基本知識

一、消毒方法

目前,常用的消毒方法多采用物理方法(如干熱法、濕熱法、過濾法、射線法等)和化學方法(消毒劑、抗生素)兩大類。


1.干熱法

是利用恒溫干燥箱內160℃~170℃的高熱,并保持90~120分鐘,殺死細菌和芽孢,達到目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽器中進行,且不易被高溫損壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的。用此方法的物品干燥,易于貯存。酒精燈火焰燒灼法也是屬于干熱的方法之一,在進行微生物檢測工作時,常須利用工作臺面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進行補充。


2.濕熱法

壓力蒸汽濕熱法是目前常用的一種方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環境中存在的潛熱作用和良好的穿透力,使菌體蛋白質凝固變性而使微生物死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和培養基的。高壓蒸汽器的蒸汽壓力一般調整為0.10-0.11MPa,維持20~30min即可達到效果。


3.射線法

利用紫外線燈進行照射的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射,可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機制是通過對微生物的核酸及蛋白質等的破壞作用而使其滅活。適合于實驗室空氣、地面、操作臺面。時間為30min。用紫外線時應注意,不能邊照射邊進行實驗操作,因為紫外線不僅對人體皮膚有傷害,而且對培養物及一些試劑等也會產生不良影響。

4.過濾法
是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾,使大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留,從而達到的方法。過濾法大多用于遇熱易發生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養基等。

目前,常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾,或用玻璃細菌濾器、濾球負壓過濾。濾膜孔徑應在0.22~0.45μm范圍內或用更小的細菌濾膜,溶液通過濾膜后,細菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻,并利用濾膜的吸附作用,阻制小于濾膜孔徑的細菌透過。

5.化學消毒劑消毒法
用于那些不能利用物理方法進行的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實驗器皿等。常用的化學消毒劑包括甲醛、高錳酸鉀、70%~75%乙醇、過氧乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%~75%乙醇、0.1%~0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進行實驗材料的;利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進行無菌室和培養室的消毒。在使用時應注意安全,特別是用在皮膚或實驗材料上的消毒劑,須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時間,才能達到安全和的目的。

6.抗生素抑菌法
主要用于培養基,是培養過程中預防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴重時的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。

二、不同種類物品及培養物的消毒方法


1.無菌操作室
由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細菌和真菌孢子,因此長期停用后的無菌操作室應進行熏蒸,熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進行無菌室的。經常使用的無菌操作室,在每次使用前都應進行地面衛生清潔,并用紫外線燈照射30min,進行空氣。對超凈工作臺,每次操作前用紫外燈照射30min,然后用70%~75%酒精擦拭。

2.培養液
培養液在制備過程中帶有各種雜菌,分裝后應立即,至少也應在4小時內完成工序。目前常用過濾法除去培養物操作液和培養液中的細菌?;驅ε囵B液中耐熱組分先進行高壓蒸汽,然后在無菌室加入經過過濾的不耐熱溶液,混勻后分裝備用。

使用高壓蒸汽器時,將分裝好的培養液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽器內,增壓至0.035~0.040 MPa時排凈器內冷空氣,以便使蒸汽能到達各個消毒部位,保證消毒徹底。然后繼續加壓加熱,當壓力表讀數達到0.10~0.11MPa為121℃,保持15~20min即可。由于消毒效果取決于溫度而不是壓力,所以在一定壓力下保持較長的消毒時間是須要的。

在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽孢桿菌,因此許多培養液的消毒壓力、溫度一般保持在0.10~0.11MPa、121℃。消毒時間與需要消毒的培養液量密切相關(表1),時間不足達不到效果,時間過長培養液內的一些化學物質遭到破壞,影響培養液成分。消毒結束后,關閉熱源,只有當器內壓力降為零時才能打開放氣閥,排除剩余蒸汽,取出培養液。不可在壓力較高時打開放氣閥,引起減壓沸騰,使容器中液體溢出。培養液組成中如含有遇熱易分解的物質,則需用過濾方法消毒。首先對培養液中耐熱組分進行高壓蒸汽后放置在無菌場所,固體培養液在40℃左右瓊脂即將凝結前,加入經過過濾的不耐熱溶液,混勻后冷卻備用。


表1 培養基高壓蒸汽所需的少時間圖片

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械

玻璃器皿可進行干熱或高壓蒸汽,但在蒸汽后及時烘干水分。對不能進行高壓蒸汽的塑料器皿可用75%酒精浸泡,使用前在無菌操作臺面上晾干的同時,用紫外線重復。實驗室還可以用環氧乙烷袋對塑料器皿進行消毒,消毒后的器皿要充分散氣2~4小時后才可使用。無菌操作所用的各種器械,一般采用干熱或高壓蒸汽,或用75%酒精浸泡,然后在無菌操作臺面上晾干的同時再用紫外線重復;在使用期間可多次對其進行酒精燈火焰灼燒。

4.培養材料的消毒
采自動物機體的實驗材料,攜帶著微生物及雜質,接種前須進行表面消毒,對內部已受微生物侵染的材料應予以淘汰。從動物機體采集的某些組織塊,須用消毒劑進行浸泡處理,進行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫(10~12%,浸泡5~15 min)、過氧乙酸(0.05%,浸泡30s~1min)、酒精(70~75%,浸泡2 min)。

表2 常用消毒劑消毒效果比較表

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表3 實驗中常用物品的消毒方法選擇

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三、程序驗證內容

撰寫驗證方案及制定評估標準。

確認設備技術資料齊全、安裝正確,并能處于正常運行。

確認關鍵設備控制儀表在規定的參數范圍內能正常運行。

采用被物品或模擬物品進行重復實驗確認效果符合規定。

完善文件記錄,撰寫驗證報告。

四、程序運行監控

關鍵參數應在驗證確定的范圍內:溫度、壓力、時間、濕度、氣體濃度、輻照劑量等。

程序定期驗證,時效不超過半年。

設備或程序發生變更重新進行驗證。



五、保證

效果與前產品污染程度及污染菌特性有關,把握微生物污染水平及污染菌耐受性,注意各個環節降低污染程度。

冷卻階段防止已物品再次污染。

適用生物指示劑、化學指示劑等監控結果。

六、生物指示劑

基本要求:

菌種的耐受性應大于需產品中所有可能污染菌的耐受性。

菌種應無致病性。

菌株應穩定,存活期長,易于保存。

易于培養。若使用休眠孢子,孢子含量在90%以上。

七、常用生物指示劑

濕熱:嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(ATCC7953等,活孢子數為5×105~5×106個/片)。

干熱:枯草芽孢桿菌孢子(ATCC9372等,活孢子數為5×105~5×106個/片)。

輻射:短小芽孢桿菌孢子(ATCC27142等,活孢子數為5×107~5×108個/片)。

八、小結

高壓蒸汽法:用高溫加高壓,不僅可殺死一般的細菌,對細菌芽胞也有殺滅效果,是可靠、應用普遍的物理法。主要用于能耐高溫的物品,如金屬器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡膠及一些藥物和部分培養基的。


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